EMS-индуцированная мутация W216 *, идентифицированная в мутантной линии Kronos K4222, приводит к преждевременному стоп-кодону и усечению 51% белок WAPO-A1. Усеченная область включает последовательности, высоко консервативные среди трав, что позволяет предположить, что усеченный белок либо нефункционален, либо имеет очень пониженную активность. Модифицированная активность усеченного гена W216 * была подтверждена значительным снижением SNS в линиях, несущих мутантный аллель wapo-A1 , по сравнению с линиями, несущими аллель дикого типа (WT) в трех различных экспериментах (рис. 1).В тепличном эксперименте средний SNS линий F ₃ , гомозиготных по wapo-A1 EMS-мутанту, был на 1,7 колоска ниже (снижение на 14%, P <0,001), чем у сестринских линий, гомозиготных по аллелю WT (рис. 1A). ). Аналогичное сокращение на 1,4 колоска (уменьшение на 7,3%, P <0,001) наблюдалось в полевом эксперименте с использованием гомозиготных сестринских линий F ₄ для аллелей wapo-A1 и WT (рис. 1B).

Различия в количестве колосков на спайк (SNS) между гомозиготными сестринскими линиями Kronos, расщепляющими по EMS-индуцированной мутации wapo-A1 W216 * или по CRISPR-индуцированной мутации wapo-A1 и wapo-B1 . A ) F ₃ сестринских линий, оцененных в теплице. ( B ) F ₄ сестринских линий, оцененных в полевых условиях. ( C ) BC ₁ F ₃ сестринских линий, оцененных в полевых условиях. ( D ) График взаимодействия, показывающий влияние мутантов CRISPR с потерей функции в wapo-A1 и wapo-B1 в тетраплоидных растениях Kronos пшеницы без трансгена. Факториальный дисперсионный анализ представлен в таблице S2A. ( E ) Степень доминирования [16] для WAPO-A1 (на фоне wapo-B1 ) и WAPO-B1 (на фоне wapo-A1 ).Столбцы — это средние значения для социальных сетей, а столбцы ошибок — s.e.m. * = P <0,05, ** = P <0,01 и *** = P <0,001. ** = P <0,01, *** P <0,001.

Чтобы уменьшить потенциальную изменчивость, происходящую от фоновых мутаций, и более точно определить эффект усечения W216 *, мы дважды скрестили мутант K4222 с WT Kronos и выбрали гомозиготные BC ₁ F ₂ сестринских линий для дополнительной полевой оценки с использованием их BC ₁ F ₃ зерен.Растения BC ₁ F ₃ , гомозиготные по wapo-A1 , имели в среднем на 1,1 меньше колосков на колос по сравнению с сестринской линией WT (6,0% снижение, P = 0,0035, рис. 1C). Взятые вместе, эти три эксперимента демонстрируют, что потеря функции гомеолога A-генома WAPO1 достаточна для значительного снижения SNS.

Чтобы проверить действие гомеолога WAPO-B1 и подтвердить результаты для EMS-индуцированного мутанта wapo-A1 , мы создали три независимых трансгенных растения Kronos T ₀ CRISPR-Cas9 с направляющей РНК, нацеленной на обоих гомеологов. .Мы идентифицировали одну линию со вставкой «Т» в позиции 510 от ATG (4 п.н. выше сайта CGG PAM) как в WAPO-A1 , так и в WAPO-B1 , и выбрали ее для дальнейшей характеристики. Эта вставка со сдвигом рамки считывания изменяет 61,4% белковой последовательности (начиная с аминокислоты 171), что, вероятно, приводит к потере функции обоих гомеологов WAPO1 . Мы генотипировали 110 T ₁ растений, полученных из отобранного трансгенного объекта, с использованием описанных маркеров WAPO-A1 и WAPO-B1 CAPS (таблица S1).Доля линий, гомозиготных по аллелям WT Wapo-A1 (2,7%) и / или Wapo-B1 (4,5%), была значительно ниже ожидаемых 25%, что предполагает непрерывное редактирование CRISPR. Эта гипотеза была подтверждена идентификацией новой делеции со сдвигом рамки считывания 5 п.н., начинающейся с позиции 505 в WAPO-B1 (4 п.н. выше сайта PAM) в линии T ₁ -40, которая была повторно секвенирована. и скрестили с WT Kronos для устранения трансгена CRISPR-Cas9.

Мы создали линии, гомозиготные по всем четырем возможным комбинациям гомеологов WAPO1 — WT, wapo-A1, wapo-B1 и wapo1 с двойным мутантом — путем отбора потомства F ₂ , полученного от F ₁ без трансгена CRISPR-Cas9.В эксперименте с камерой роста мы оценили эффекты двух гомеологов и их взаимодействия на SNS (рис. 1D), время заглатывания и количество листьев (таблица S2). Факторный дисперсионный анализ показал очень значимые различия для SNS (таблица S2A), но незначительные различия для даты заголовка (таблица S2B) или количества листьев (таблица S2C).

Оба мутанта wapo-A1 и wapo-B1 имели значительно более низкий SNS, чем WT ( P < 0,0001, рис. 1D, таблица S2A), с большим сокращением wapo-B1 (3.7 колосков), чем в wapo-A1 (1,3 колоска). Уровни транскриптов двух гомеологов также различались, с более высокими уровнями WAPO-B1 , чем WAPO-A1 на разных стадиях развития спайков (рисунок S1). Эффект аллеля wapo-A1 на SNS был максимальным, когда гомеолог B-генома был гомозиготным по wapo-B1 , и наоборот, приводя к высокозначимому взаимодействию ( P = 0,0096, рис. 1D, таблица S2A. ). Частичное доминирование на WAPO-A1 (D = 0.61) и WAPO-B1 (D = 0,58) локусов (рис. 1E) указывают на частичную функциональную избыточность между двумя копиями в каждом из гомеологов WAPO1 .

Трансгенные растения с дополнительными

Мы клонировали геномные области WAPO-A1 из диплоидной пшеницы T. monococcum (TmDV92) и тетраплоидного Лэнгдона с естественным (LDN- C47) и отредактировал аллель (LDN-F47) и преобразовал их в Kronos, чтобы проверить их влияние на дату заголовка и SNS.Клонированные области генома включают интронные и регуляторные области (см. Материалы и методы), а их кодирующие области несут разные несинонимичные полиморфизмы (Таблица 1).

Сравнение регуляторных и кодирующих областей WAPO-A1 в Kronos дикого типа (гаплотип h2) и трех геномных конструкций, используемых в трансгенных растениях.

Мы получили четыре независимых трансгенных события для TmDV92, три для LDN-C47 и пять для аллеля, производного от LDN-F47, и оценили их соответствующее потомство T ₁ в тепличном эксперименте (рис. 2).Трансгенные растения для всех трех конструкций показали аналогичное среднее увеличение SNS по сравнению с WT: LDN-C47 (13,4%), TmDV92 (15,1%) и LDN-F47 (15,5%) (рис. 2). Увеличение SNS было значительным для двух событий TmDV92, одного события LDN-C47 (рис. 2A) и четырех независимых событий LDN-F47 по сравнению с контролем WT (рис. 2C).

Влияние аллелей WAPO-A1 из TmDV92 и тетраплоидного LDN на количество колосков в колосе и дату колошения. ( A-B ) Тепличный эксперимент по сравнению четырех независимых трансгенных линий TmDV92 и трех независимых линий, несущих аллель LDN-C47, с их соответствующими нетрансгенными сестринскими линиями Kronos (объединенными из различных событий).( C-D ) Отдельный тепличный эксперимент, сравнивающий пять независимых трансгенных линий, несущих аллель LDN-F47, с пулом нетрансгенных сестринских линий. (A и C) Число колосков на колос. (B и D) Дата заголовка. Столбцы — это средние значения, а столбцы ошибок — s.e.m. Цифры внутри столбцов указывают количество растений, а звездочки указывают значения P (тест Даннета) относительно пула нетрансгенных сестринских линий, несущих ту же конструкцию. * = P <0,05, ** = P <0.01 и *** = P <0,001.

Эффекты трансгенов на дату заголовка были меньшими и несколько менее значительными, чем эффекты для социальных сетей. Для даты заголовка задержка на 7,0% наблюдалась у трансгенных растений с конструкцией LDN-C47, задержка на 5,4% для TmDV92 и задержка на 6,3% для LDN-F47 (рис. 2B и D). Дата заголовка положительно коррелировала с SNS среди линий T ₁ , сегрегированных для каждой из трех конструкций ( R = 0,49-089, P <0.01). Для события F47-2, которое показало самую сильную задержку времени колошения и высокий SNS (рис. 2C-D), мы подтвердили наличие значительно более высоких уровней транскрипта WAPO-A1 в развивающихся шипах трансгенных растений по сравнению с Сестринская линия WT (рисунок S2). Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что присутствие дополнительных копий WAPO1 в трансгенных растениях увеличивает SNS и задерживает дату заголовка.

Мы также оценили SNS и дату заголовка в трансгенных растениях, экспрессирующих кодирующие области Wapo-A1c (C47) и Wapo-A1b (F47), каждая из которых слита с C-концевой меткой MYC и управляется конститутивной кукурузой . Промоутер UBIQUITIN .С помощью qRT-PCR мы измерили уровней транскрипта WAPO-A1 в листьях 11 независимых событий для UBI :: C47: MYC и 14 событий для UBI :: F47: MYC (рисунок S3A). Трансгенные линии для всех событий показали более высокие уровни транскрипта WAPO-A1 в листьях, чем нетрансгенные линии Kronos, где экспрессия WAPO-A1 не была обнаружена. Мы выбрали события с наивысшим уровнем расшифровки для дальнейшей оценки; E35 для UBI :: C47: MYC (11,5-кратный ACTIN ) и E53 для UBI :: F47: MYC (12.3-кратный ACTIN ). Трансгенное потомство T ₂ этих линий возглавило значительно позже, чем нетрансгенные сестринские линии (рисунок S3B), но не показало значительных различий в SNS (рисунок S3C).

CRISPR

Помимо продукции меньшего количества SNS, двойной мутант wapo1 показал большое разнообразие цветочных аномалий и дал ограниченное количество зерен. Чтобы установить частоту различных аномалий цветков, мы выделили 91 цветочек из 32 колосков, расположенных в разных положениях вдоль колоса, у 14 различных мутантных растений wapo1 .В то время как чешуйки, чешуйки и чешуйки были нормальными, в других органах цветков наблюдались множественные отклонения от нормы. Лодикулы, которых обычно по два на цветочек, варьировали от нуля до четырех (в среднем 1,95, рис. 3A) и часто сливались с тычинками (19,1%), листовой тканью (22,5%) или с обоими (5,6%, рис. 3B- D). Число тычинок на цветочек было меньше трех у 42% цветков (рис. 3 A-D), что в среднем составляло 2,15 тычинок на цветочек. Тычинки часто срастались друг с другом или с яичниками (6.6%), лодикулы (18,9%), листообразная ткань (9,2%) или комбинации двух из трех предыдущих категорий (4,6%, рис. 3B и C). У большинства цветков был один пестик с одной завязью, но у 43% цветков было несколько пестиков, вероятно, из-за потери детерминированности меристемы цветков. У 28,4% цветков завязи срослись с листовой тканью (рис. 3D).

Цветочные аномалии и профили экспрессии мутанта CRISPR с потерей функции Kronos wapo1 ( wapo-A1 wapo-B1 ).( A ) Мутант T ₁ -101, первый цветочек базального колоска с тремя лодикулами, одной тычинкой и двумя сросшимися пестиками. ( B ) Мутант T ₁ -101, 2 ^и цветочек из 3 ^rd самого дистального колоска. Лодикулы срослись с тычинками и листовой тканью. Пестики индетерминантные, сросшиеся с листовой тканью. ( C ) Мутант T ₁ -13, 2 ^и цветочек базального колоска. Один листок слился с листовой тканью, а промежуточный орган слился с листовой тканью, а пестик слился с листовой тканью.( D ) Мутант T ₁ -13, 3 ^rd цветочек базального колоска. Лодикулы с удлиненной листовой тканью, промежуточным органом и индетерминантными пестиками. Lm = лемма, Pa = palea, Ld = lodicule, St = тычинка, Pi = пестик, Lf = сросшаяся листовая ткань, + = сросшиеся органы. ( E-G ) Анализ экспрессии генов MADS-box класса A, -B, -C и -E у мутантов Kronos и wapo1 (номенклатура генов MADS-box основана на [17]). Праймеры перечислены в таблице S1. Столбцы представляют собой средние значения четырех повторов, а столбцы ошибок — s.Эм. Каждая повторность представляет собой пул из 12 меристем на стадии зачатков тычинок (∼W4.0 по шкале Ваддингтона). ns = не значимо, * = P <0,05, ** = P <0,01 и *** = P <0,001.

Поскольку большинство цветочных аномалий в wapo1 было обнаружено во внутренних оборотах (лодикулах, тычинках и пестиках), мы исследовали влияние мутанта wapo1 на экспрессию класса-B, -C и -E MADS. -box цветочные гены в развивающихся шипах на стадии зачатков тычинок.По сравнению с WT мутант wapo1 показал значительную понижающую регуляцию генов класса B ( AP3-1 и PI1 ) и класса C ( AG1 и AG2 ) MADS-box генов ( Рис. 3E-G), но не было обнаружено значительных различий для контроля SEPALLATA MADS-box гены SEP1- 2, SEP1- 2, SEP1-4, SEP1-6 или SEP3-1 (Рис. 3H).

Среди T ₁ растений, сегрегированных на три трансгенных WAPO1 копий, управляемых их нативными промоторами, события, показывающие значительные различия в SNS, также показали аномалии шипов (рис. ).Одним из необычных фенотипов было наличие голых пестиков у основания колосков, расположенных в базальных положениях колоса (Рис. 4A-C). Эта аномалия наблюдалась у некоторых растений из событий TmDV92-1, LDN-C47-3, LDN-F47-2 и LDN-F47-6 (рис. 4A-C).

Цветочные аномалии у растений Kronos, трансформированных геномными областями WAPO-A1 . ( A ) Спайки нетрансгенных контрольных (WT) и трансгенных линий TmDV92-1 и LDN-C47-3. ( B ) Деталь голых пестиков под базальными колосками в TmDV92-1 (желтые стрелки на A).( C ) Голый пестик под 2 ^и колоском в LDN-F47. ( D ) Деталь аномального дистального конца шипа TmDV92-1 (красные стрелки в A). ( E и F ) LDN-C47-3. ( E ) Первый цветочек в 5 ^{-ом колоске} от основания: уменьшенная палея, одна тычинка, без пестика. ( F ) Второй цветочек в 11 ^{колоске} от основания: без лодикул, лишние пестики срослись с небольшими пестиками. ( G и H ) TmDV92-1.( G ) Первый цветочек от базального колоска: небольшая палея и нормальный цветок. ( H ) 17 ^{-й колоск} от основания: одна лодикула, две тычинки и индетерминантные пестики. ( I и J ) LDN-F47-2. ( I ) Третий цветочек от базального колоска: 4 лодикулы, одна срослась с палеой. ( J ) Колоск 19 ^th : 2 маленькие тычинки и три пестика (одна срослась с палеа, а другая с леммой. Lm = лемма, Pa = палеа, Ld = lodicule, St = тычинка, Pi = пестик.

Более частой аномалией колоса было наличие более мелких, плотно упакованных колосков в дистальной области колоса, заканчивающихся небольшим концевым колоском. Для простоты эту аномалию спайков в дальнейшем называют маленьким концевым колоском (красные стрелки на рис. 4A и D). Для события LDN-F47-3, которое не показало значимых различий в SNS, ни одно из растений T ₁ не имело маленьких концевых колосков, тогда как этот фенотип наблюдался у 91,6% растений T ₁ LDN-F47-5. , событие с наибольшим увеличением количества соцсетей (26%).Три других события LDN-47 показали значительное, но меньшее увеличение SNS (от 9 до 24%), чем сестринские линии WT, и имели небольшие концевые колоски примерно в половине линий T ₁ (от 47 до 50%). Была обнаружена сильная корреляция между долей колосков, показывающих маленькие концевые колоски, и процентным увеличением SNS ( R = 0,85, n = 5), предполагая, что увеличение SNS у этих трансгенных растений было связано с дополнительными более мелкими колосками в дистальный отдел шипа.

Рассечение колосков в различных положениях колоса выявило возрастающие цветочные аномалии от базальных положений до апикальной области у LDN-C47-3 (рис. 4 EF), TmDV92-1 (рис. 4 GH), LDN-F47-2 ( Рис. 4 IJ) и LDN-F47-4 (Рис. S4). Аномальные цветочные структуры включали (i) небольшие палеа, (ii) переменное количество лодикул, тычинок и пестиков на цветочек, и (iii) частые слияния этих трех органов, а также чешуек и пестиков (рис. 4 E-J). Трансгенная линия LDN-F47-4 имела самый экстремальный фенотип, показывающий множественные голые пестики, которые были больше у базальных колосков и переходили в прицветники в более дистальных колосках (рисунок S4A-B).В колосках около концевого колоска было больше пестиков и меньше других органов (рисунок S4C). Напротив, у базальных колосков LDN-F47-4 были более крупные чешуйки, чешуйки и тычинки, особенно в дистальных соцветиях (рисунок S4D-G).

Мы также охарактеризовали колосья и соцветия трансгенных растений, трансформированных конструкциями UBI :: C47: MYC (E35) и UBI :: F47: MYC (E53). Неожиданно эти трансгенные растения показали более легкие дефекты колосьев и цветков (рисунок S5), чем растения, трансформированные геномными областями WAPO-A1 (фиг.4 и рисунок S4), возможно, из-за слитой MYC-метки.Большинство растений UBI :: C47: MYC и UBI :: F47: MYC имели небольшие концевые колоски (рисунок S5A-B), а небольшая часть растений имела голые пестики на нижней стороне базальных колосков (рисунок S5C). В то время как большинство цветков растений UBI :: C47: MYC и UBI :: F47: MYC имели небольшие и иногда изогнутые бледные области, количество органов было сходным с WT. Чаще всего наблюдались слияния органов между палеасами и лодикулами, тогда как слияния тычинок были (рисунок S5D-E). Явных аномалий на пестиках не обнаружено.

Мы не наблюдали значительных фенотипических различий между трансгенными растениями, трансформированными UBI :: C47: MYC (E35) и UBI :: F47: MYC (E53), или между растениями, трансформированными тремя разными геномными конструкциями, что позволяет предположить, что все эти аллели кодируют активные белки. Большая вариабельность между различными событиями для одного и того же конструкта препятствовала обнаружению меньших количественных различий между конструкциями.

Естественная вариация в

Характеристика естественных вариантов WAPO-A1 дополнила информацию, полученную в результате индуцированных мутаций и трансгенных событий, описанных выше.В нашем предыдущем исследовании мы установили, что аллель WAPO-A1 в гаплотипе h3 был связан с более высоким SNS, чем гаплотипы h2 и h4 [10], но мы не определяли относительное влияние гаплотипов h2 и h4 на SNS. . Чтобы ответить на этот вопрос, мы провели два полевых эксперимента, организованных по схеме RCBD с разделенными участками в 2020 году (рис. 5A, таблица S3A) и 2021 году (рис. 5B-D, таблицы S3B-F). В обоих экспериментах было 10 повторов, каждая из которых включала восемь семейств в качестве основных участков и гомозиготные сестринские линии h2 и h4 в качестве подзаговоров.В эксперименте 2020 года средний SNS для растений, гомозиготных по гаплотипу h4, был на 6% выше, чем для гомозиготных по гаплотипу h2 в 2020 году (1,3 колоска) и на 7,3% выше в 2021 году (1,6 колоска). Общие различия в SNS были очень значимыми в оба года ( P <0,0001, рис. 5A и B, таблицы S3A и B). Внутри отдельных семей различия в SNS между h2 и h4 были значительными для шести из 8 семей в 2020 году и для всех семей в 2021 году (таблицы S3A и B).

Влияние гаплотипов h2 (Kronos) и h4 (Rusty) WAPO-A1 на уровни транскриптов SNS и WAPO-A1 . ( A ) Полевой эксперимент RCBD 2020 г. ( B-D ) Полевой эксперимент RCBD в 2021 году. ( B ) Количество колосков на колос. ( C ) Число зерен на колосе. ( D ) Урожайность зерна (кг / га) ( E — F ) Два независимых эксперимента qRT-PCR, в которых сравниваются уровни транскриптов h2 и h4 WAPO-A1 относительно ACTIN с использованием метода 2 ^▵Ct . C ) Пулы развивающихся шипов, собранные при наличии зачатков леммы (W3.25). ( D ) Пулы развивающихся колосьев, собранные при наличии зачатков цветков (W3.5). Столбцы представляют собой средние значения, а полосы ошибок — s.e.m. Цифры внутри столбцов указывают количество повторений. ns = не значимо, * = P <0,05 и *** = P <0,001. Комбинированный дисперсионный анализ ANOVA для C и D с использованием эксперимента в качестве блока показал значительные различия в экспрессии между h2 и h4 ( P = 0.0128).

В эксперименте 2021 года у нас было больше доступных зерен, поэтому мы могли использовать небольшие участки (1,86 м ² ) в качестве экспериментальных единиц для предварительной оценки урожайности зерна. В этом эксперименте генотип h4 показал увеличение GNS на 2,7% ( P = 0,0085, рис. 5C, таблица S3C) и снижение веса ядра на 1,7% ( P = 0,0319, таблица S3D) по сравнению с h2. Баланс этой отрицательной корреляции составлял увеличение урожая зерна на 5,0%, но разница была незначительно незначительной ( P = 0.0525, рис. 5D, таблица S3E). В этом эксперименте мы не обнаружили существенных различий во времени заголовка ( P = 0,5987, таблица S3F).

Чтобы проверить, связаны ли различия в SNS между гаплотипами h2 и h4 с различиями в уровнях экспрессии WAPO-A1 , мы провели два независимых эксперимента qRT-PCR, сравнивая гомозиготные сестринские линии h2 и h4, полученные из HIF # 120. На стадии зачатков леммы (W3.25) для первого эксперимента и на стадии зачатков цветков (W3.5) для второго эксперимента (рис. 5E и F). В первом эксперименте уровни транскриптов в h4 были на 80% выше, чем в h2, но разница не была значимой ( P = 0,07, фиг. 5E). Во втором эксперименте уровни транскриптов в h4 были на 197% выше, чем в h2, и различия были очень значимыми ( P = 0,0003, фиг. 5F). Поскольку два эксперимента показали одну и ту же тенденцию, мы выполнили комбинированный дисперсионный анализ, используя эксперимент в качестве блока.Этот анализ подтвердил значительно более высокие уровни транскрипта WAPO-A1 в h4, чем в h2 ( P = 0,0128).

В том же поле, которое использовалось для сравнения гаплотипов h2 и h4 в 2021 году, мы также сравнили относительные эффекты гаплотипов h3 и h2 в почти изогенных линиях (NIL) тетраплоидной пшеницы Kronos и гексаплоидной пшеницы GID4314513 (линия с высокой биомассой). от СИММИТ). В тетраплоиде BC ₃ F ₃ NIL мы не обнаружили значительных различий в датах заголовков (рис. 6A), но наблюдали 17.На 6% больше колосков на колос ( P <0,0001, рис. 6B) и на 6,7 зерен на колос ( P = 0,025, рис. 6C) в h3-NIL, чем в h2-NIL (таблица S4). Вес зерна на колос (количество зерен x вес зерна) был на 5,8% выше в h3-NIL, чем в h2-NIL, но различия не были значительными ( P = 0,11, рис. 6D, таблица S4). Общий урожай зерна в этом эксперименте не оценивался, поскольку экспериментальные единицы были однорядными.

Эффект WAPO-A1 гаплотипов h3, интрогрессированных в тетраплоид Kronos (h2) и гексаплоидную линию с высокой биомассой GID4314513 (h2) в полевых экспериментах (2021).( A-D ) Гомозиготный BC ₃ F ₃ сестринских линий (CRD, n = 9, 1-метровые ряды, по 10 шипов в каждом ряду). ( A ) Дата заголовка. ( B ) Количество колосков на колос. ( C ) Число зерен на колосе. ( D ) Масса зерна на колос. ( E-F ) Гомозиготный BC ₅ F ₃ сестринских линий (RCBD, n = 10, 1,86 м ² делянок, по 4 шипа на делянке). Планки погрешностей — s.e.m. ns = незначительно, * = P <0.05, ** = P <0,01, *** = P <0,001.

В гексаплоиде BC ₅ F ₃ NIL мы обнаружили на 6,1% увеличение SNS в h3-NIL по сравнению с h2-NIL ( P = 0,0092, рис. 6E) и увеличение на 8,4%. урожай зерна, который был незначительным ( P = 0,0497, рис. 6F, S4E-F, таблица 4). Гаплотип h3 также был связан с незначительными различиями в GNS (+2,7%), количестве зерен в колоске (-3,3%), массе тысячи зерен (+1.8%) и массы зерна на колос (+4,4%, таблица S4G-J).

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем предыдущем исследовании мы идентифицировали WAPO-A1 как ведущий ген-кандидат для 7AL SNS QTL на основе двух генетических карт высокого разрешения [10]. В этом исследовании мы демонстрируем, что WAPO1 является одновременно необходимым и достаточным для увеличения SNS у пшеницы и, следовательно, что WAPO-A1 является причинным геном, лежащим в основе 7AL QTL для SNS.

Возможные механизмы, участвующие в эффекте

Различия в уровнях транскрипта WAPO-A1 в разных генотипах хорошо коррелируют с различиями в SNS.Сниженная экспрессия аллеля WAPO-A1 (делеция промотора 115 п.н.) в h2 по сравнению с гаплотипами h3 [10] и h4 (рис. 5) связана с более низким SNS в h2 по сравнению с двумя другими гаплотипами. Точно так же более высокие уровни транскрипта WAPO-B1 по сравнению с WAPO-A1 во время развития спайков связаны с более сильными эффектами мутации wapo-B1 на SNS по сравнению с wapo-A1 (рис. 2B). Эти результаты вместе с частичным кодоминантным эффектом WAPO1 на SNS (рис.1E) и повышенный уровень SNS в трансгенных растениях с дополнительными геномными копиями WAPO-A1 (рис. 2) подтверждают гипотезу о том, что более высокие уровни транскрипта WAPO1 могут приводить к увеличению SNS.

Увеличение SNS означает задержку перехода меристемы соцветия (IM) в терминальный колоск. Три косвенных доказательства предполагают, что экспрессия WAPO1 в IM пшеницы, вероятно, участвует в этом механизме. Во-первых, экспериментов по гибридизации с in situ на рисе показали, что APO1 , ортолог WAPO1 риса, экспрессируется в IM [11].Во-вторых, мы ранее показали с помощью qRT-PCR, что WAPO-A1 экспрессируется на более высоких уровнях в дистальной части ранних развивающихся спайков, чем в более базальных областях [10]. Наконец, мы показываем, что трансгенные растения с конститутивной экспрессией WAPO-A1 , управляемой промотором UBIQUITIN , имеют более компактные кончики шипов и меньшие концевые колоски (рис. 4), подтверждая влияние этого гена на дистальную часть шип.

В рисе APO1 физически взаимодействует с LFY (APO2), и два гена действуют совместно, контролируя количество колосков на метелку [13].Об аналогичных взаимодействиях in vitro и in vivo сообщалось между UFO и LFY, гомологами Arabidopsis [12, 18]. Мутанты для обоих генов обнаруживают сходные дефекты в структуре и морфологии соцветий, указывая тем самым, что эти два гена также действуют совместно, чтобы способствовать идентичности цветочно-меристемы [19]. Основываясь на результатах риса и арабидопсиса, мы предполагаем, что LFY может участвовать в механизме, с помощью которого WAPO1 регулирует SNS в пшенице. Было бы интересно исследовать взаимодействия между этими двумя генами и генами MADS-box из клад SQUAMOSA и SVP , которые, как было ранее показано, также влияют на SNS у пшеницы [20, 21].

Аномалии цветков и колосков у мутантных и трансгенных

Было показано, что помимо связывания с промотором AP1 , LFY связывается с регуляторными областями APETALA3 ( AP3 , класс a). -B цветочный ген) и AGAMOUS ( AG , цветочные гены класса C) у Arabidopsis [12, 22-24]. Активация экспрессии AP3 требует активности как LFY , так и UFO , что, вероятно, объясняет сообщенное подавление генов класса B у мутанта ufo у Arabidopsis [12, 15] и генов класса C у Arabidopsis. мутант apo1 в рисе [14].У пшеницы мы также наблюдали подавление генов класса B и -C, но не генов класса E в развивающихся шипах двойного мутанта wapo1 относительно WT, что свидетельствует о консервативном молекулярном механизме.

У Arabidopsis гены MADS-box класса B и класса C связаны с идентичностью лепестков, тычинок и пестиков, что объясняет более сильные аномалии, обнаруженные у мутантов ufo в трех внутренних оборотах цветка. Было также показано, что эктопическая экспрессия как PI , так и AP3 устраняет дефекты идентичности органов цветка у мутанта Arabidopsis ufo [25].Более сильные дефекты цветков во внутренних оборотах цветков, чем в чешуях, чешуях и чешуях, были зарегистрированы у риса [14] и мутанта пшеницы wapo1 в этом исследовании. Родственные дефекты цветков, наблюдаемые у мутантов ufo, apo1 и wapo1 , подтверждают функциональную консервацию этих гомологичных генов в делении однодольных eudicot.

Трансгенные растения пшеницы с дополнительными геномными копиями WAPO1 разделяли некоторые цветочные аберрации с мутантом wapo1 , включая различия в количестве лодикул, тычинок и пестиков и слиянии между органами.Эти результаты предполагают, что уменьшение или увеличение экспрессии WAPO1 может приводить к аномальному развитию трех внутренних оборотов цветочка. Трансгенные растения WAPO-A1 , как с нативным, так и с промотором UBI , показали дополнительные фенотипы, не наблюдаемые у мутанта wapo1 , в том числе уменьшенные и иногда изогнутые палео (гомологичные чашелистикам), компактный кончик шипа с небольшим концом колосков и значительная задержка времени колошения. Мы не знаем, являются ли эти дополнительные фенотипы в трансгенных растениях косвенным эффектом повышенных уровней экспрессии WAPO1 , или результатом эктопической экспрессии из-за промотора UBI или отсутствием важных регуляторных элементов в клонированном нативном растении. промоутерский регион.

Наше предыдущее исследование показало, что гаплотип h3 был связан с большим увеличением SNS, чем гаплотипы h2 и h4 в нескольких сегрегированных популяциях.Благоприятное влияние h3 на SNS наблюдалось у яровой и озимой пшеницы, а также у различных рыночных классов пшеницы, но это увеличение не всегда приводило к увеличению урожайности зерна. В генотипах или средах с недостаточными ресурсами для заполнения лишних зерен увеличение GNS было компенсировано уменьшением веса зерна. Однако, когда h3 присутствовал в хорошо адаптированных и продуктивных генотипах, выращенных в благоприятных условиях, увеличение SNS было связано с увеличением урожайности зерна [10].В этом исследовании мы также наблюдали значительное увеличение урожайности зерна, когда гаплотип h3 был интрогрессирован в высокопродуктивную линию из программы высокой биомассы от CIMMYT. При благоприятных условиях орошения и удобрения, использованных в этом исследовании, увеличение SNS, связанного с гаплотипом h3, было связано с увеличением общего урожая зерна на 8,4%. Это многообещающий предварительный результат, но он должен быть дополнительно подтвержден более крупными испытаниями урожайности на различных генетических основах.

Увеличение частоты гаплотипа h3 было ранее описано у мягкой пшеницы с менее чем 50% у старых староместных сортов до более чем 80% у современных сортов пшеницы [10]. Это говорит о том, что отбор на высокий SNS, GNS или урожай зерна, возможно, ускорил увеличение частот h3. Напротив, у тетраплоидной пшеницы гаплотип h2 заменил гаплотип h4 и стал почти фиксированным у современных твердых сортов (99%) [10]. Это увеличение частоты h2 нельзя объяснить выбором более высоких SNS или GNS, потому что наш полевой эксперимент показал, что h2 имеет значительно более низкие SNS и GNS, чем h4 (рис. 5).Поскольку у твердой пшеницы зерна намного больше, чем у мягкой пшеницы, мы предполагаем, что отбор на более крупные зерна мог привести к косвенному отбору для уменьшения количества зерен в пользу аллеля h2. Этот косвенный отбор, вероятно, был вызван отрицательной корреляцией между количеством зерен и массой, компромисс усиливается в сортах с ограниченным источником и / или в неоптимальных условиях.

Низкая частота h3 у твердой пшеницы может быть результатом того же непрямого отбора для меньшего и большего количества зерен, но также возможно, что h3 никогда не тестировался должным образом на современных сортах твердой пшеницы.Гаплотип h3 уже был редкостью у культивируемых эммеров, где только один образец h3 (из Сирии) был идентифицирован при обследовании 364 сортов твердой пшеницы [10]. В этом исследовании мы показываем, что перенос h3 из мягкой пшеницы в тетраплоидную пшеницу Kronos был связан со значительным увеличением SNS и GNS. О подобном благоприятном влиянии h3 по сравнению с h2 на SNS ранее сообщалось в сегрегированной популяции, полученной от скрещивания культивируемой пшеницы emmer и твердой пшеницы в полевых испытаниях в Фарго (Северная Дакота) [10].Это многообещающие результаты, но они все еще требуют проверки на различных сортах твердой древесины и более крупных испытаний урожайности. Чтобы облегчить интрогрессию гаплотипа h3 в твердой пшенице, мы депонировали Kronos NIL с интрогрессией h3 в Национальную коллекцию мелкого зерна (число PI ожидается).

Таким образом, проверка WAPO-A1 как причинного гена 7AL SNS QTL и положительного влияния гаплотипа h3 на количество колосов и количество зерен в колосе предоставляет селекционерам пшеницы новый инструмент для улучшения свойств поглощения без существенно влияет на время движения курса.Мы предполагаем, что интрогрессия гаплотипа h3 в сорта, которые не ограничены по исходным признакам (например, сорта с высокой биомассой), может привести к увеличению общего урожая зерна в благоприятных условиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мутации, индуцированные этилметансульфонатом (EMS) в

Мы проверили базу данных секвенированных EMS-индуцированных мутаций в тетраплоидном сорте пшеницы Kronos [30] с использованием последовательности WAPO-A1 ( TraesCS7A02G481600 ).Для гомеолога A-генома ( WAPO-A1 ) мы идентифицировали линию K4222, несущую мутацию, которая приводит к замене триптофана на преждевременный стоп-кодон в положении 216 белка (W216 *). Для гомеолога B-генома ( WAPO-B1 ) мы идентифицировали пять мутаций, которые приводили к аминокислотным изменениям, но ни одна из них не приводила к преждевременным стоп-кодонам или измененным сайтам сплайсинга; следовательно, наши последующие исследования включали только мутант WAPO-A1 . Мы скрестили мутант K4222 с немутагенизированным Kronos, самоопылились с F ₁ , и из сегрегированных растений F ₂ мы выбрали сестринские линии, гомозиготные по мутанту ( wapo-A1 ) и аллелям WT ( Wapo-A1 ).Полученные растения F ₃ оценивали в теплице, а растения F ₄ в поле. Для дальнейшего снижения фоновых мутаций мы создали гомозиготные сестринские линии BC ₁ F ₂ путем обратного скрещивания F ₁ с Kronos, самоопыления BC ₁ и отбора гомозиготных растений в следующем поколении. Производные BC ₁ F ₃ зерен были посажены в полевом эксперименте.

Для тепличного эксперимента мы использовали два растения F ₃ на горшок (3.8 л) и измеренное среднее значение SNS на растение. В первом полевом эксперименте мы высаживали гомозиготные мутантные и сестринские линии WT F ₄ по полной рандомизированной схеме (CRD) с 10 повторами на каждый генотип. Каждая повторность включала ряд из 2-5 растений, расположенных на расстоянии 0,3 метра друг от друга. Среднее SNS на ряд рассчитывали путем измерения SNS по 3 шипам на растение. Во втором полевом эксперименте мы посадили BC ₁ F ₃ растений на расстоянии 0,3 м друг от друга, разделяя по аллелям WAPO-A1 .Генотипирование этих растений выявило 11 гомозиготных wapo-A1 и 8 гомозиготных WT в пределах того же семейства №54 BC ₁ . Для каждого растения мы определили средний SNS по четырем шипам. Оба полевых эксперимента были проведены на экспериментальной полевой станции Калифорнийского университета в Дэвисе, далее именуемой UC Davis, в течение месяцев с октября 2019 года по июнь 2020 года.

Генерация двойных мутантов

Чтобы лучше охарактеризовать функцию WAPO1 , мы отредактировали оба гомеолога тетраплоидной разновидности Kronos с помощью CRISPR-Cas9 [31].Мы разработали одну направляющую РНК между положениями 494 и 512 от начального ATG кодирующей области (таблица S1), чтобы вызвать двухцепочечные разрывы в первом экзоне как WAPO-A1 , так и WAPO-B1 . Затем эту направляющую РНК клонировали в вектор, который включал ген Cas9 и химеру GRF4-GIF1 , повышающую эффективность регенерации пшеницы для трансформации, опосредованной Agrobacterium- [32]. Три независимых трансгенных растения Kronos Т ₀ были получены из центра трансформации растений UCD и проверены на мутации путем секвенирования следующего поколения (NGS) и переваривания рестрикционными ферментами.Для скрининга NGS мы использовали праймеры g641-NGS-F и R, которые амплифицируют оба генома (таблица S1), и проанализировали данные с помощью CRISgo (https://github.com/pinbo/CRISgo), как опубликовано ранее [33]. Для скрининга рестрикционных ферментов мы использовали пару праймеров, специфичных для A-генома CAPS- WAPO-A1 -F и R1, и пару специфичных для B-генома праймеров CAPS- WAPO-B1 -F и R2 (таблица S1) с последующим перевариванием. с рестрикционным ферментом Xcm I. Те же самые праймеры и расщепление рестрикционным ферментом использовали в качестве маркеров последовательности амплифицированного полиморфизма расщепления (CAPS) для последующих поколений.

Генерация

Чтобы проверить роль WAPO-A1 в регуляции SNS, мы создали трансгенные растения, экспрессирующие ген WAPO-A1 , управляемый его природным промотором. Геномная область WAPO-A1 , которая включала 4,8 т.п.н. выше стартового кодона, полную кодирующую область с его интроном и 1,5 т.п.н. ниже стоп-кодона, была клонирована в бинарный вектор устойчивости к гигромицину pLC41. Три различных аллеля WAPO-A1 , каждый из которых кодирует другой белок WAPO-A1 (таблица 1), были клонированы и трансформированы в Kronos.Первая геномная область WAPO-A ^m 1 была получена из библиотеки ВАС диплоида T. monococcum ssp. monococcum , образец DV92, далее TmDV92 (геном A ^m ) [34]. Белок WAPO-A ^m 1, кодируемый аллелем TmDV92, отличается от WAPO-A1 полиплоидной пшеницы на три аминокислоты, но в остальном сходен с гаплотипом h4 (таблица 1). Вторая геномная область WAPO-A1 была клонирована из библиотеки ВАС T.turgidum ssp. durum сорт Лэнгдон [35]. Эта конструкция, обозначенная в дальнейшем как LDN-C47, кодирует предковый аллель Wapo-A1d (h4), который не имеет делеции в промоторной области, и предковые аминокислоты C47 и D384 (таблица 1)

Третья конструкция, названная LDN-F47 был создан посредством сайт-направленного мутагенеза конструкции LDN-C47 с использованием праймеров, описанных в таблице S1. Замена предкового цистеина (C47) на фенилаланин (F47) привела к образованию белка, идентичного тому, который кодируется аллелем Wapo-A1b в гаплотипе h3 (Таблица 1).Однако клон LDN-F47 отличается от естественной геномной области h3 тремя SNP в промоторной области и двумя в первом интроне [10]. В таблице 1 представлены сводные данные о различных конструкциях WAPO-A1 и их сравнение с эндогенным аллелем Wapo-A1a (h2), присутствующим в трансформированном разнообразии Kronos.

Чтобы проверить эффект конститутивной экспрессии WAPO-A1 , мы создали две дополнительные конструкции WAPO-A1 с использованием того же вектора pLC41.Эти конструкции включали промотор убиквитина кукурузы (UBI), синтезированные кодирующих областей WAPO1 для гаплотипов h4 (C47) и h3 (F47), а также тег MYC, далее обозначаемый как UBI :: C47: MYC и UBI :: F47: MYC соответственно. Кодирующая область WAPO1 была синтезирована Genewiz в вектор pUC57. Кодирующую область WAPO1 амплифицировали с использованием праймеров BP, перечисленных в таблице S1. Амплифицированный продукт ПЦР экстрагировали в геле (Qiagen) и рекомбинировали в pDONRzeo с использованием Life Technologies BP Clonase II в соответствии с протоколом производителя.Вектор pDONRzeo, содержащий желаемую кодирующую область WAPO1, рекомбинировали в вектор pLC41 с использованием Life Technologies LR Clonase II, следуя протоколу производителя. Клоны проверяли секвенированием по Сэнгеру на каждом этапе клонирования.

трансформировали в Kronos с использованием трансформации, опосредованной Agrobacterium- (EHA105), в центре трансформации растений Калифорнийского университета в Дэвисе, как описано ранее [32]. Праймеры, перечисленные в таблице S1, использовали для генотипирования трансгенных растений и подтверждения присутствия трансгена.Трансгенные растения T ₀ были продвинуты до T ₁ и охарактеризованы в теплице по дате колошения, SNS, а также морфологии колоса и цветков. Уровни транскриптов UBI :: C47: MYC и UBI: F47 MIC в листьях определяли с помощью qRT-PCR с использованием праймеров в таблице S1. Экстракцию и анализ экспрессии РНК проводили, как описано ранее [36].

Популяции, использованные для сравнения эффектов гаплотипов

В нашем предыдущем исследовании гаплотип WAPO-A1b h3 был связан со значительно более высоким SNS, чем гаплотипы h2 и h4 у мягкой пшеницы, но Относительное влияние h4 и h2 на SNS не проверялось [10].Чтобы сравнить влияние гаплотипов h2 и h4 на SNS, мы разработали популяцию, разделяющую гаплотип h2 из Kronos и гаплотип h4 из сорта твердой пшеницы Rusty (Таблица 1), который нес тот же аллель Wapo-A1d , что и Лэнгдон [10]. От скрещивания Kronos x Rusty [37] 75 растений F ₂ были продвинуты до F ₄ методом спуска одного семени (SDS) и генотипированы по гаплотипу WAPO-A1 с использованием молекулярного маркера, ранее разработанного для WAPO. Делеция промотора -A1 [10].Мы выбрали восемь гетерозиготных растений F ₄ (ID = 12, 19, 51, 55, 69, 113, 120, 128) для создания восьми гетерозиготных инбридных семейств (HIF). Для каждого HIF F _{4: 5} мы выбрали две гомозиготные сестринские линии (F _{4: 6} ) — одна фиксированная для h2, а другая фиксированная для h4.

Зерна F _{4: 6} были использованы для двух полевых испытаний, проведенных на экспериментальной полевой станции Калифорнийского университета в Дэвисе, которые были посажены в октябре и собраны в июне следующего года. В экспериментах будут использованы урожайные годы 2020 и 2021 годов.Оба полевых эксперимента были организованы в виде разделенного участка, рандомизированного полного блочного дизайна (RCBD) с 10 повторениями, с использованием восьми HIF в качестве основных графиков и сестринских линий, фиксированных для гаплотипов h2 и h4 в качестве подзаголовков. Мы использовали отдельные ряды в качестве экспериментальных единиц в эксперименте 2020 года и небольшие участки (3 ряда = 1,86 м ² ) в эксперименте 2021 года. В 2021 году мы также измеряли дату колошения как время от первого дождя после посева до момента, когда половина растений на участке взошла, количество зерен на колос (каждая повторность была в среднем из 3 колосов) и общий урожай зерна. в кг / га (небольшие участки убирали комбайном Wintersteiger).

Чтобы сравнить эффект h3 по сравнению с h2, мы разработали NIL, разделяющие эти гаплотипы как у тетраплоидной, так и у гексаплоидной пшеницы. Тетраплоидные NIL были разработаны путем интрогрессии гаплотипа WAPO-A1 h3 из селекционной линии UCD мягкой пшеницы UC1110 (также называемой CAP1, используемой как самка) в тетраплоидный сорт пшеницы Kronos с использованием обратного скрещивания с помощью маркеров. После трех обратных скрещиваний с Kronos мы самоопыляли растения BC ₃ и выбрали растения BC ₃ F ₂ , гомозиготные по гаплотипам h2 и h3.Полученные зерна BC ₃ F ₃ были посеяны в Калифорнийском университете в Дэвисе в ноябре 2020 года по полностью рандомизированной схеме (CRD) с девятью повторениями, используя 1-метровые ряды в качестве экспериментальных единиц (10 колосьев были измерены в каждом ряду и усреднены). Гексаплоидные NIL были разработаны путем обратного скрещивания гаплотипа h3 пять раз с гексаплоидной линией GID4314513 (h2) из ​​программы CIMMYT с высокой биомассой. Мы выбрали линию с высокой биомассой в качестве повторяющейся родительской линии, чтобы увеличить вероятность того, что увеличение SNS и GNS будет транслироваться в повышение урожайности зерна.Мы разработали BC ₅ F ₃ гомозиготных NIL, используя GID4314513 в качестве рекуррентного родителя, и сравнили их в полевых условиях в Калифорнийском университете в Дэвисе в 2021 году, используя RCBD с 10 повторениями и 3-рядными небольшими участками (1,86 м ² ) в качестве экспериментальных. единицы. Мы измерили 4 колоса на делянке (подвыборки) и собрали небольшие делянки комбайном.

Исследования экспрессии

Чтобы проверить, связаны ли различия в SNS между h4 и h2 с разными уровнями экспрессии WAPO-A1 , мы сравнили уровни транскриптов этого гена в развивающихся спайках гомозиготных сестринских линий h2 и h4, полученных из HIF №120. WAPO-A1 Уровни транскрипта определяли с помощью qRT-PCR с использованием специфичных для A-генома праймеров UFO-A-RT-F2 и UFO-A-RT-R2 и условий ПЦР, описанных в нашем предыдущем исследовании [10]. Реакции проводили на системе ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) с использованием Fast SYBR GREEN Master Mix. Уровни транскрипта выражали в виде кратных уровней ACTIN с использованием метода 2 ^ΔCT .

Растения выращивали в конусах объемом 1,4 л, помещенных в камеры для выращивания CONVIRON, при 16-часовом освещении при 22 ° C (интенсивность 330 моль) и 8-часовом темноте при 17 ° C в течение 25-30 дней.Для каждой повторности мы объединили 3-8 развивающихся шипов от основного побега, когда зачатки леммы были видны (W3.25) в первом эксперименте и когда зачатки цветков присутствовали (W3.5) во втором эксперименте. Стадии развития спайков основаны на шкале Waddington [38]. Мы проанализировали два эксперимента отдельно и в комбинированном ANOVA, используя эксперименты в качестве блока.

Чтобы сравнить уровни транскриптов генов MADS-box класса B, -C и -E у Kronos и мутанта wapo1 , мы экстрагировали РНК из растений, выращенных в камере для выращивания CONVIRON в аналогичных условиях, как описано выше.Экстракцию и анализ экспрессии РНК проводили, как описано ранее [36]. Меристемы вскрывали, когда растения находились на стадии 6-7 листьев на стадии зачатков тычинок (∼W4.0). В каждой повторности объединяли 12 меристем.

Статистический анализ

Взаимодействия между WAPO-A1 и WAPO-B1 тестировали с использованием факторного дисперсионного анализа 2 × 2 с использованием гомеологов в качестве факторов и аллелей (мутанты WT и CRISPR) в качестве уровней. Четыре возможных гомозиготных класса — WT, wapo-A1, wapo-B1 и двойной мутант wapo1 — были отобраны из потомства F ₂ растения F ₁ от скрещивания wapo1 x Kronos WT. без трансгена CRISPR-Cas9.

Для трансгенных линий TmDV92, LDN-C47 и LDN-F47 мы получили от трех до пяти различных трансгенных событий. Поскольку количество нетрансгенных сестринских линий Т ₁ было небольшим для каждого события, мы объединили нетрансгенные сестринские линии из разных событий, созданных с помощью одной и той же конструкции. Затем мы сравнили различные трансгенные объекты с объединенными нетрансгенными линиями с той же конструкцией, используя тесты Даннета. Все статистические анализы были выполнены с помощью SAS версии 9.4. Однородность дисперсии проверялась с использованием критерия Левена, а нормальность остатка — с помощью теста Шапиро-Уилкса, реализованного в SAS v9.4. При необходимости данные были преобразованы, чтобы восстановить предположения ANOVA.

Количество зерен и распределение урожайности по колосу остаются стабильными, несмотря на селекцию на высокую урожайность озимой пшеницы

Abstract

Две популяции озимой пшеницы ( Triticum aestivum L.), т. Е. 180 генетических ресурсов и 210 элитных сортов, были сравнены в полевых испытаниях для анализа того, как количество зерен и распределение урожайности вдоль колоса менялись в процессе селекции и как это связано с чертами, связанными с урожайностью.Элиты показали в среднем на 38% больше доходности по сравнению с ресурсами. Это селекционное улучшение в основном связано с увеличением количества зерен и урожайности с колоса в дополнение к зернам и урожайности с колоса. Эти приросты составили 19, 23, 21 и 25% соответственно. У элит наблюдался незначительный прирост массы тысячи зерен (4%) по сравнению с ресурсами. Число колосков на колос не коррелировало или даже отрицательно коррелировало с большинством признаков, за исключением зерен на колос, что позволяет предположить, что этот признак не был предпочтительным во время селекции.Распределение количества зерен и урожайности зерен вдоль шипа (GDAS и GYDAS) измеряли и сравнивали с помощью нового математического инструмента. GDAS и GYDAS измеряют отклонение интересующего шипа от архитектуры модельного шипа с равномерным распределением зерна и урожайности по всем колоскам, соответственно. Обе черты положительно коррелировали. Элиты показали в среднем только 1% улучшение значений GDAS и GYDAS по сравнению с ресурсами. Это сравнение показало, что разведение увеличивало количество зерен и урожайность равномерно вдоль колоса без изменения относительной урожайности отдельных колосков, тем самым поддерживая общую архитектуру колоса.

Образец цитирования: Philipp N, Weichert H, Bohra U, Weschke W., Schulthess AW, Weber H (2018) Количество зерна и распределение урожайности зерна вдоль колоса остаются стабильными, несмотря на селекцию для получения высокой урожайности озимой пшеницы. PLoS ONE 13 (10): e0205452. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205452

Редактор: Аймин Чжан, Институт генетики и биологии развития Китайской академии наук, КИТАЙ

Поступила: 15 июня 2018 г .; Одобрена: 25 сентября 2018 г .; Опубликован: 10 октября 2018 г.

Авторские права: © 2018 Philipp et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: AWS был поддержан Федеральным министерством образования и исследований Германии в рамках GeneBank2.0 Проект (Грант FKZ031B0184A). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Пшеница ( Triticum spp.) Составляет 30% мирового производства зерна и 45% питательных веществ зерновых, таким образом, представляя собой один из основных видов продовольственных культур [1]. За последние годы фактические темпы производства пшеницы увеличились всего на 0.5% в год, что намного меньше требуемых 1,4%, которые необходимы для того, чтобы справиться с все еще растущей популяцией людей [2, 3]. Следовательно, повышение урожайности пшеницы должно быть достигнуто за счет дальнейшего увеличения урожайности зерна с площади. Однако текущий рост урожайности пшеницы замедляется, и индекс урожая приближается к теоретическому пределу. Более того, доступный генетический фонд, по-видимому, в значительной степени исчерпан, а современное разведение еще больше привело к снижению генетической изменчивости [1]. В этом отношении использование генетических ресурсов пшеницы может быть многообещающим для преодоления этого недостатка [4].

Урожайность зерна пшеницы в основном ограничена поглотителем, и зерно растет в условиях насыщенного источника [5]. Повышенное разделение ассимилятов на развивающиеся колосья и зерно оказало наибольшее влияние на повышение потенциала урожайности пшеницы в прошлом, что привело к увеличению индекса урожая, но с гораздо меньшим приростом биомассы [6]. Прирост урожая в прошлом в основном связан с увеличением количества зерен на единицу площади, а не с увеличением размера зерен [7]. Урожайность зерна — сложный признак и результат мультипликативного взаимодействия компонентов [8].Несколько исследований на пшенице выявили некоторые количественные признаки, влияющие на урожай зерна, которые совмещены с локусами, связанными с его компонентами, что предполагает частично общий генетический контроль этих признаков [9–12]. Компоненты урожайности пшеницы многогранны [13] и охватывают два основных параметра: урожай зерна с площади и урожай зерна с колоса. Урожайность зерна с площади включает количество зерен с колоса, массу зерна и колосьев с площади; тогда как урожай зерна на колос включает количество колосков на колосе, количество зерен и размер зерна на колосе и / или колоске.Между различными компонентами урожайности существует множество взаимодействий и механизмов компенсации, зависящих от взаимодействий генотип x среда x агрономия [13]. В этом смысле важные, связанные с урожайностью характеристики, такие как масса и количество зерен, часто имеют отрицательную корреляцию [14].

Колосья пшеницы содержит от 24 до 28 колосков, каждый с несколькими цветочками. Зерна могут различаться по стадии развития, весу, количеству и эффективности плодоношения при сравнении между разными колосками и даже в пределах отдельных колосков [15].Средние колоски имеют больше и более тяжелые зерна, чем базальные и верхние колоски [16]. Количество колосков, масса зерен и количество зерен в колоске также оказывают значительное влияние на массу тысячи зерен (TGW) и количество зерен в колосе. Степень и скорость заполнения зерен в отдельных колосках сильно различаются в зависимости от их положения на колоске [17].

Естественная изменчивость, представленная в генетических ресурсах пшеницы, представляет собой важный инициатор генетического прогресса [18].Сравнение связанных с урожайностью признаков генетических ресурсов и элитных сортов может помочь оценить и понять прогресс в селекции и селекции. Цели этого исследования заключались в (i) количественной оценке различий в урожайности зерна и связанных с урожайностью признаков между двумя популяциями 180 генетических ресурсов и 210 элитных сортов озимой пшеницы ( Triticum aestivum L.), (ii) выявление наиболее релевантных компоненты урожая, ответственные за повышение урожайности зерна у элитных сортов, и (iii) изучить, каким образом количество зерна и распределение урожая зерна вдоль колоса изменялись во время селекции.

Материалы и методы

Растительный материал

Настоящее исследование включает две популяции озимой пшеницы. Первый включает 180 генетических ресурсов, отобранных случайным образом из немецкого Федерального банка генов ex situ сельскохозяйственных и садовых культур, который поддерживается Институтом генетики растений и исследований сельскохозяйственных культур в Гатерслебене. Вторую популяцию составляют 210 европейских элитных сортов, выведенных из проектов GABI-WHEAT [19] и VALID [20] (таблица S1).Большинство образцов популяции генетических ресурсов происходят из Западной Европы (43%), Восточной Европы (20%), Южной Европы (7%) и Северной Европы (6%), а 5% и 4% — из Азии. и Северная Америка соответственно. Происхождение 15% образцов было неизвестно (рис. 1А). Разновидности элитной популяции происходили из Западной Европы (41%), Северной Европы (33%) и Восточной Европы (23%), а для остальных 3% происхождение было неизвестно (рис. 1B).

Полевые испытания

Популяции были протестированы вместе с использованием неполного блочного дизайна (альфа-решетка) с двумя повторностями в Гатерслебене, Германия (51 ° 49 ’19 широты.74 «северной широты, 11 ° 17 ‘11,80» восточной долготы, 110,5 м над уровнем моря, чернозем глинистого суглинка, среднегодовая температура 9 ° C, среднегодовое количество осадков 490 мм). Разновидность Apache повторяли десять раз в каждой репликации, чтобы заполнить количество участков на репликацию до 400 для оптимальной рандомизации в неполных блоках. Опытная единица соответствовала делянку площадью 5 м ² с густотой посева 220 семян на м ² . Удобрения, регуляторы роста, гербициды и фунгициды применялись в соответствии с местными сельскохозяйственными методами.Перед сбором урожая с каждого участка в каждой повторности отбирали пять основных шипов и хранили для дальнейших исследований. После обмолота зерна, собранные с каждого участка, взвешивали, и урожай зерна выражали в Mg ha ^-1 .

Исследование спайковой архитектуры

Всего было исследовано около 4000 колосков (10 на генотип; 100 разновидностей наполнителя Apache) на количество колосков на колос, количество зерен на колосок и урожай зерна с колоса (г). Колоски осторожно удаляли пошагово снизу вверх.С каждого колоска зерна удаляли, очищали и взвешивали. Были рассчитаны урожай зерна на колосе и количество зерен на колосе, а также мера распределения зерна вдоль колоса (GDAS) и распределение урожайности зерна вдоль колоса (GYDAS). Среднее значение признака по пяти исследованным пикам на участке было использовано для дальнейшего анализа. Зерна со всех пяти колосьев одного участка были объединены и проанализированы с помощью анализатора семян MARVIN (www.gta-sensorik.com) на TGW (г), длину зерна (мм), ширину зерна (мм) и площадь зерна (мм ² ). ).

Колоски на колосе различаются по плодовитости. Это можно измерить по количеству зерен и урожайности зерен (г) отдельных колосков. Следовательно, общее количество зерен и общий урожай зерна колоса более или менее равномерно распределены по колючке. Чтобы количественно определить, какой вид распределения (четный или неравномерный) был выбран селекционерами растений, мы разработали меру для сравнения равномерности GYDAS и GDAS среди колосьев. Эта мера представляет собой математический термин, основанный на косинусе угла двух векторов и может быть подробно описан следующим образом:

Был принят модельный колос с идеальной GYDAS с абсолютно равномерным распределением урожая зерна по всем колоскам и использован для сравнения с интересующим колосом.Сравнение интересующего спайка с модельным спайком происходит в векторном пространстве размерности n , размеры которого определяются общим числом колосков интересующего спайка. Геометрическая разница в GYDAS между двумя пиками основана на скалярном произведении этих двух векторов: (1) где направления двух векторов отличаются друг от друга на определенный угол, что отражает различие в распределении урожайности зерна между интересующим шипом a и модельным шипом b .Термин основан на разнице косинуса угла между модельным спайком и интересующим спайком. Помимо количества колосков на колос, термин использует параметры урожайности зерна на колос и урожай зерна на колос для описания GYDAS или количества зерен на колос и количества зерен на колос для описания GDAS. Для примера GYDAS это можно записать как: (2) где a _i и b _i — урожай зерна (или количество зерен) i -го колоса (из общего числа n колосков) колоса интереса и всплеска модели соответственно.Из-за равномерного распределения урожая зерна по всем колоскам в модельном колосе b _i строго равно единице, а последнее уравнение сводится к следующему: (3) где равно урожайности зерна интересующего шипа (GYS): (4) Значение косинуса является мерой распределения вдоль шипа. Чем выше значение косинуса, тем лучше (более ровно) GYDAS или GDAS (рис. 2). При значении 1 угол разницы равен 0 °, что означает, что интересующий спайк имеет то же распределение, что и модельный спайк.

Рис. 2. Контрастные значения распределения урожайности зерна вдоль колоса (GYDAS).

(A) Генетический ресурс TRI_1218 и (B) элитный сорт Лимерик, а также (C) пример колоса, показывающий нумерацию колосков в соответствии с положением на колосе.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205452.g002

Оценка соответствующих количественных генетических параметров

Для анализа фенотипических данных мы применили следующую линейную смешанную модель для каждого признака: (5) где y _ijk — полевые характеристики i -го генотипа в j -м блоке и k -м блоке, μ пересечение, g _i эффект i -й генотип, r _j эффект j -я репликация, b _{k ( j )} эффект k -й блок, вложенный в j -ю репликацию , а e _ijk , это ошибка y _ijk .Для коррекции выбросов генотип принимался за фиксированный фактор, а репликация и блокировка считались случайными. Записи удалялись как выбросы, если их стандартизированные остатки превышали определенный порог согласно [21]. Впоследствии модель в уравнении (5) была адаптирована снова, чтобы оценить наилучшие линейные несмещенные оценки (BLUE). Для оценки компонентов дисперсии данные, скорректированные на выбросы, были дополнены следующей модифицированной моделью, чтобы отдельно оценить компоненты генетической дисперсии для популяции генетических ресурсов и элитных сортов: (6) где y _ijkl — полевые характеристики i -го генотипа в j -й репликации, k -м блоке и l -й популяции, μ пересечение, p _l влияние l -й популяции, g _{i ( l )} влияние i -го генотипа на l -ю популяцию, r _j эффект j -я репликация, b _{k ( j )} эффект k -го блока, вложенного в j -ю репликацию, и e _ijkl , ошибка из y _ijkl .Фиктивные переменные [22] кодировали наличие (1) генотипов в –-й популяции и отсутствие (0) генотипов, принадлежащих другой популяции, и не отображались в модели. Для оценки компонентов дисперсии генотипов, блоков репликации и ошибок они были приняты как случайные факторы, тогда как среднее значение по совокупности рассматривалось как фиксированный фактор. Компоненты дисперсии использовались для оценки повторяемости как: (7) где относится к генотипической дисперсии, к дисперсии ошибок и Nr . rep к количеству повторов. Значимость разницы в средних популяциях между генетическими ресурсами и элитными сортами была проверена с помощью t-критерия для сравнения двух выборок на основе оцененных значений BLUE. Значимость компонентов генетической дисперсии оценивалась с помощью теста отношения правдоподобия, который учитывал соответствующие правдоподобия полной и сокращенной моделей. Генетические отклонения считались значительно различающимися между популяциями, если их приблизительные доверительные интервалы (генетические отклонения плюс / минус удвоенные стандартные ошибки) не перекрывались.Корреляции Пирсона между СИНИМИ признаками были рассчитаны отдельно для генетических ресурсов и элитных сортов.

Чтобы проанализировать вклад отдельных колосков в общее количество зерен и урожайность колоса в популяциях генетических ресурсов и элитных сортов, мы применили следующую модель: (8) где y _ijkl — количество зерен или урожай зерна i -го колоса (шаг веретена) в j -й популяции, k -й репликации и l -й блок, μ точка пересечения , ( sp ) _ij эффект колоса i ( s ) в популяции j ( p ), r _k влияние k -я репликация, b _l эффект l -го блока, вложенного в k -ю репликацию, и e _ijkl ошибка y _ijkl .Для оценки BLUE ( sp ) _ij было принято как фиксированный коэффициент, все остальные как случайные факторы. Линейные смешанные модели были реализованы с использованием ASReml-R [23], а все статистические процедуры выполнялись в среде R [24].

Результаты

Генетические ресурсы и элитные сорта различаются средней разницей урожайности зерна 38,11%

Качество данных, как показывают оценки повторяемости, было от среднего до высокого и варьировалось от 0.46 для GDAS и 0,94 для длины зерна в популяции генетических ресурсов и от 0,63 для GDAS до 0,93 для длины зерна в популяции элитных сортов (Таблица 1). Все компоненты генетической дисперсии достоверно отличались от нуля (значение P <0,001). Различия в генетической дисперсии между популяциями были значительными (значение P <0,05) только для урожайности зерна на колос, TGW, ширины зерна, площади зерна и урожайности зерна. В то время как генетическая дисперсия урожайности зерна на колос в элитной популяции была увеличена на 109%, генетическая дисперсия других упомянутых признаков снизилась до 59% по сравнению с популяцией генетических ресурсов.Различия в средних значениях между двумя популяциями были значительными (значение P <0,05) для всех исследованных признаков, за исключением длины зерна. Незначительное увеличение средств элитной популяции по сравнению с генетическими ресурсами наблюдалось для GDAS (1,06%), GYDAS (1,03%), площади зерна (2,21%), ширины зерна (2,36%) и TGW (3,80%) (Таблица 1, рис 3). Значительно более высокий рост наблюдался для зерен на колос (19,05%) и урожайности зерна на колос (23,22%), а также зерна на колос (21,25%) и урожайность зерна на колос (25.03%), а наибольший прирост был отмечен по урожайности делянки (38,11%). Единственным признаком с незначительным снижением среднего значения по сравнению с генетическими ресурсами были колоски на колос (-1,95%).

Рис. 3.

Распределение наилучших линейных несмещенных оценок (BLUE) 12 признаков, связанных с урожайностью (A-L), измеренных в двух популяциях озимой пшеницы из 180 генетических ресурсов (Ресурс) и 210 элитных сортов (Элита). P-value указывает на существенно разные средние значения между популяциями; нс, не имеет значения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205452.g003

Таблица 1. Статистика первой и второй степени ^a из 12 признаков, связанных с урожайностью, исследованных в двух популяциях озимой пшеницы со 180 генетическими ресурсами и 210 элитные сорта, а также различия средних и дисперсионных популяций ^b по отношению к популяции генетических ресурсов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205452.t001

Основной вклад в количество зерен и урожайность зерна с колоса дает нижняя половина колосков

Анализируя вклад отдельных колосков в общий урожай зерна и количество зерен в колосе (уравнение 8), было замечено, что урожайность зерна как в элите, так и в ресурсах была неравномерно распределена по колоскам колоса.В частности, вклад в урожай зерна был в основном сконцентрирован в колосках от четырех до четырнадцати (рис. 4A). То же самое верно и для распределения количества зерен вдоль шипа (рис. 4В). Среднее сравнение показало, что и количество зерен, и урожайность зерна увеличились в элитах во всех колосках вдоль колоса. Однако относительный вклад в урожай на один колоск, то есть процентное соотношение вкладов отдельных колосков в общий урожай колоса, было практически одинаковым для элит и ресурсов (рис. 4C).Обратите внимание, что GDAS и GYDAS являются мерой для сравнения равномерности числа зерен и распределения урожая зерна вдоль шипа между популяциями, показанными на рис. 4A и рис. 4B, соответственно. Средний вес отдельных колосков, рассчитанный путем деления урожайности колосков (Рис. 4A) на количество зерен на колосок (Рис. 4B), был незначительно увеличен для элитных растений в базовой и средней части колоса (Рис. 4D). Взятые вместе, результаты показывают, что преимущество в урожайности элитных колосьев в основном достигается за счет большего количества зерен вдоль всего колоса, тогда как относительный вклад отдельных колосков вдоль колоса почти не изменился.

Рис. 4. Распределение признаков урожайности вдоль колоса для популяции 180 генетических ресурсов (Ресурс) и 210 элитных сортов (Элита).

(A) урожай зерна на колоск, (B) зерна на колоск, (C) относительный вклад урожая на колосок и (D) средний вес зерна на колоск.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205452.g004

Корреляция урожайности зерна в популяции элитных сортов в целом снизилась

Две группы корреляций были четко определены в матрице корреляции признаков (таблица 2): корреляции, значения которых сохранялись между популяциями, и те, значения которых различались при переходе от ресурсов к элитному материалу (таблица 2).Существенных изменений знака арифметики (+, -), т.е. когда положительная значимая корреляция смещается в сторону отрицательной значимой при переходе от ресурсов к элитному материалу или наоборот, не наблюдалось. В этом разделе мы выделили несколько интересных примеров, отражающих эти результаты. В популяции элитных сортов самые высокие и достоверные корреляции (значение P <0,001) наблюдались между GDAS и GYDAS (0,97), урожайностью зерна на колос и зерном на колос (0,85), зерном на колоске и зерном на колосе (0.88), зерна на колос и урожай зерна на колос (0,77), урожай зерна на колос и урожай зерна на колос (0,90), а также урожай зерна на колосок и зерна на колоск (0,83). Корреляция между характеристиками размера зерна: TGW, длина зерна, ширина зерна и площадь зерна в целом были высокими с коэффициентами корреляции до 0,90 между площадью зерна и TGW. В этом отношении только корреляция между шириной зерна и длиной зерна была низкой (0,29). Аналогичные корреляции наблюдались и в популяции генетических ресурсов.Интересно, что колоски на колос имеют отрицательную корреляцию с GDAS и GYDAS и положительно коррелируют с количеством зерен на колос и урожайностью зерна с колоса в обеих популяциях. Тем не менее, эти корреляции находились на уровне от низкого до умеренного. В элитной популяции GDAS умеренно коррелировал с зерном на колос (0,51), урожайностью зерна на колос (0,51), зерном на колос (0,69) и урожайностью зерна на колос (0,65). В отличие от популяции генетических ресурсов GDAS значительно меньше коррелировал с зерном на колос (0.27), урожай зерна с колоса (0,28), зерна с колоса (0,40) и урожай зерна с колоса (0,37). Аналогичная тенденция наблюдалась и для корреляций указанных признаков с GYDAS в обеих популяциях. Не наблюдалось заметной корреляции для GDAS или GYDAS с урожаем зерна для обеих популяций, так как связь между GDAS и урожайностью зерна (0,18) едва значима. В популяции генетических ресурсов урожайность зерна умеренно коррелировала с урожайностью зерна с колоса (0.39), урожайность зерна на колос (0,43), ширину зерна (0,41) и TGW (0,28), в то время как в элитной популяции эти корреляции были примерно вдвое меньше для урожайности зерна на колос (0,26), урожайности зерна на колос (0,20) и зерна ширина (0,16). И последнее, но не менее важное: корреляция между урожайностью зерна и TGW не была значимой для элитного населения.

Таблица 2. Коэффициенты корреляции Пирсона между 12 признаками, связанными с урожайностью, измеренными в двух популяциях озимой пшеницы 180 генетических ресурсов (верхний треугольник) и 210 элитных сортов (нижний треугольник).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205452.t002

Обсуждение

Сравнение связанных с урожайностью признаков генетических ресурсов и элитных сортов может помочь оценить и понять прогресс селекции и селекции. В этом исследовании мы сосредоточились на разработке, описании и проверке двух новых агрономических признаков, GDAS и GYDAS, на основе двух популяций 180 генетических ресурсов и 210 элитных сортов озимой пшеницы. С помощью данных, собранных в этом контексте, мы смогли сделать выводы, в какой степени количество зерен и распределение урожайности зерна вдоль колоса изменялись в процессе селекции и как это связано с другими признаками, связанными с урожайностью.Учтите, что все найденные ассоциации ограничены одной средой и могут модулировать в других средах. Поэтому мы внимательно отнеслись к их интерпретации и полагались на вспомогательную литературу.

Повышенное количество зерен на колосе объясняет примерно половину повышения урожайности у элитных

Примерно половина 38% -ного повышения урожайности, достигнутого селекцией в элите, была связана с сопутствующим 23% -ным увеличением урожайности зерна с одного колоса (Таблица 1, Рис. 3).Это увеличение урожайности зерна на колос, в свою очередь, было связано с одновременным увеличением количества зерен на колос (прирост на 19%), количества зерен (21%) и урожайности зерна на колос (25%). Другая половина повышения урожайности, наблюдаемого в элите, может быть в основном связана с увеличением количества колосьев на 1 м ² , поскольку этот признак, наряду с урожайностью зерна на колос, соответствует одному из основных компонентов урожайности зерна у пшеницы. Более того, часто сообщалось, что существует более тесная связь между урожаем зерна и количеством зерен, чем между урожаем зерна и массой зерна [7, 25–28].Например, современные сорта английской озимой пшеницы содержат на 59% больше зерен за счет 30% дополнительных зерен на колось и на 14% больше колосьев на м. ² , но с аналогичным TGW [29], в то время как сравнение старых и современных сортов твердой пшеницы в Италии и Испании выяснилось, что селекция увеличила количество зерен на один колос на 23% из-за более высокого количества зерен на колос [30]. Наблюдение, что повышение урожайности зерна в элитах сопровождалось увеличением количества зерен на колос, но без особого прироста TGW (3.Прирост 8%) в нашем исследовании подтверждает эти прошлые выводы. Хотя история селекции показывает, что генетическое улучшение связано с увеличением количества зерен на площадь, элитные сорта, похоже, не производят больше общей биомассы, что указывает на снижение отношения источника к поглотителю [31]. Таким образом, повышение урожайности зерна происходит за счет увеличения количества биомассы, распределяемой между зернами. Наиболее важным было создание полукарликовых линий путем введения аллелей Rht , которые изменили распределение ассимилятов в ушах и увеличили фертильность колосьев [28].Другой ключевой особенностью, способствовавшей увеличению урожайности зерна, было увеличение количества водорастворимых углеводов в стеблях и листьях при цветении. Это увеличивает запасы источника и, следовательно, доступный углерод, предназначенный для наполнения зерен [7]. Эти ключевые улучшения сместили отрицательную взаимосвязь между TGW и количеством зерен на площадь в элитах, которые заполняют больше зерен без больших потерь в TGW [28].

Увеличение количества зерен в колосе достигается за счет повышения плодовитости отдельных колосков, а не увеличения количества колосков на колос

Поскольку повышенное количество зерен на колосе связано с более высоким урожаем, увеличение количества колосков на колос потенциально может увеличить количество зерен на колос.Однако количество колосков на колос уменьшилось в элите на 2% и, следовательно, не было предпочтительной целью отбора. Несмотря на то, что количество колосков на колос умеренно коррелирует с количеством зерен на колос в элитах (+0,45) и ресурсами (+0,46), корреляция с урожайностью зерна и другими характеристиками, связанными с урожаем, слабая или даже отрицательная (Таблица 2). Это указывает на то, что большее количество колосков на один колос неблагоприятно сказывается на урожайности зерна. Соответственно, для австралийской пшеницы количество колосков связано с количеством зерна, а не с урожаем зерна [32, 33].Развитие колосков у озимой пшеницы зависит от яровизации и может быть увеличено за счет увеличения периода вегетации, расстояния между растениями, температуры, азотного питания и интенсивности света [34, 35]. Это демонстрирует, что конкуренция ассимилятов в развивающемся спайке играет роль [36]. Низкая связь с урожайностью зерна и тот факт, что количество колосков связано с более длительным вегетационным периодом [32] и фазой развития колоса [37], может объяснить, почему увеличение количества колосков не было предпочтительным.

Селекция изменила средние значения многих признаков, связанных с урожайностью элитных сортов

Выбор растительного материала для получения высокой урожайности и TGW мог также косвенно повлиять на родственные признаки (Таблицы 1, 2, Рис. 3). Этот так называемый коррелированный ответ на отбор является функцией корреляции между признаками и наследуемостью признаков [38, 39]. Совместный отбор мог повлиять на средние характеристики признаков между двумя популяциями и их генетические различия. Например, отбор на более высокий TGW значительно увеличил среднее значение и уменьшил генетическую вариативность TGW, но также положительно увеличил ширину зерна коррелированных признаков и площадь зерна.Эффекты совместного отбора признаков не всегда очевидны. Заметным исключением является совместный отбор урожайности зерна и его составляющего признака урожайности на колосе. Даже несмотря на то, что селекционеры отдавали приоритет отбору растительного материала с высоким урожаем зерна и, таким образом, совместно отбирали более высокий урожай с каждого колоса; генетическая изменчивость урожайности зерна снизилась (-54,35%), но вариация урожайности на колос одновременно увеличилась в элитах (108,77%). Одно правдоподобное объяснение этому состоит в том, что недостаточный урожай с одного колоса может быть компенсирован увеличением количества колосьев на метр ² в растительном материале с многостебельным характером роста [8, 40].В этом смысле отбор высокоурожайного материала мог допускать отбор генотипов, которые не обязательно имеют высокий урожай на колос, что, в свою очередь, увеличивало генетическую дисперсию урожайности на колос в элитах. Поскольку количество выступов на 1 м ² здесь не оценивалось, мы не можем исключить другие причины. И последнее, но не менее важное: несколько корреляций характеристик изменились по величине, то есть стали слабее или сильнее при сравнении ресурсов с элитными (таблица 2). Тем не менее, эти сдвиги могут быть просто искусственными из-за усечения значений признаков [41] и массового отбора селекционерами.

Селекция не повлияла на неравномерное распределение количества зерен и урожайности по колосу

В течение большей части периода налива зерна пшеница скорее ограничена поглотителем, чем источником [42]. Снятие ограничения поглощения недавно было одобрено для дальнейшего повышения урожайности зерна [43]. Анализ архитектуры шипа как у элиты, так и у ресурсов показывает, что количество зерен, урожай зерна и средний вес зерна на колоск различаются в зависимости от положения колоска в колосе (Рис. 4A – 4D).И у элиты, и у ресурсов распределение урожайности зерна колосков очень похоже: с четырех по четырнадцатым колоскам приходится 64% урожая на один колос. Это обнадеживает, если учесть, что эти колоски, расположенные в нижней половине колоса, составляют примерно 44% от общего количества колосков. В этом смысле улучшение архитектуры шипов в сторону большей отдачи в верхних частях шипов может быть многообещающим для преодоления ограничений по опусканию.

GDAS и GYDAS как меры равномерности количества зерен и распределения урожайности зерна вдоль колоса, соответственно, были очень похожи и сильно коррелировали как по элите, так и по ресурсам (рис. 3A – 3B).И GDAS, и GYDAS только немного улучшились — на 1% в элите, что указывает на то, что сохраняется стабильная спайковая архитектура (рис. 3A и 3B; таблица 1). Таким образом, процент и вклад отдельных колосков в общий урожай колосков остается почти неизменным как для элит, так и для ресурсов (рис. 4C). Другими словами, селекция улучшила количество зерен и повысила урожайность вдоль колоса без изменения относительной отдачи урожая отдельных колосков. Такое ограниченное изменение предполагает, что эти признаки не были задействованы в селекции, вероятно, из-за низкой корреляции с урожайностью зерна (Таблица 2).С другой стороны, поддержание стабильного распределения зерна и урожайности может отражать тот факт, что характерные особенности физиологии и развития колоса нелегко изменить путем селекции с одновременным увеличением урожайности. Поскольку зерна в колосках и колосках развиваются асинхронно, а степень и скорость заполнения сильно варьируется в зависимости от положения иглы, дистальные зерна остаются меньше, чем базальные, из-за более позднего заполнения и более медленной начальной скорости заполнения, а также из-за синхронного созревания между разными зернами [44, 45 ].Более низкая скорость заполнения дистальных зерен связана с более низкими концентрациями абсцизовой кислоты и более высокими концентрациями этилена и 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты [17]. О конкуренции за ассимиляты внутри шипа сообщалось по снижению доступности ассимилятов из-за низкой освещенности, что уменьшало TGW в верхних зернах по сравнению с базальными зернами, тогда как высокая температура уменьшает размер зерна во всех положениях [42]. Возможные ограничения транспортных возможностей и конкуренция за ассимиляты между колосками и / или цветками могут повлиять на урожайность [2].Потенциальной проблемой может быть сопротивление ассимиляции движения в шипах и / или колосках [46]. Несоответствие размеров сосудистых пучков в разных сегментах шипа может иметь решающее значение, влияя на конечный размер и количество зерен вдоль рахиса [47]. В конце концов, увеличение генетической урожайности не сопровождалось аналогичным увеличением размера сосудистой сети шипа. Соответственно, не было обнаружено четкой связи между генетическим улучшением и величиной сосудистой системы в стеблях колоса [48].

Вес в тыс. Зерен был второстепенным целевым показателем селекции

Хотя селекционный прогресс в элите в основном достигается за счет увеличения количества зерен на колоске и зерен на колос, TGW был улучшен лишь незначительно (Таблица 2), а длина зерен не изменилась (Рис. 3H и 3I).TGW сильно коррелирует с шириной зерна, площадью и урожайностью зерна с колоса и колоса, но лишь умеренно с длиной зерна как в элитах, так и в ресурсах (Таблица 2), [14]. Регулировка длины и ширины зерна в значительной степени независима. Длина определяется очень рано в развитии зерна и определяется удлинением перикарпия [49, 50]. Ширина определяется позже при заполнении зерна и определяется делением клеток эндосперма, движущей силой для сахарозы между сосудистой сетью и эндоспермом и накопительной активностью [51, 52].Повышение TGW, по-видимому, было достигнуто, главным образом, за счет улучшения ширины зерна (2,36%) и площади (2,21%), а не длины (Таблица 1). Множественные компоненты урожая и характеристики колоса связаны с геном Q , присутствующим во всех современных сортах пшеницы. Q связан с уменьшенным соотношением длины зерна к весу, что приводит к более коротким и округлым зернам [53]. TGW и ширина зерна являются показателями качества помола. Более крупные и короткие зерна улучшают степень извлечения муки и качество конечного потребления [16, 54, 55].Таким образом, TGW был выбран в основном как параметр качества, а не как признак повышения урожайности зерна. Кроме того, средний вес зерна на один колос увеличивается только в нижнем и среднем колосе, с одного колоска до тринадцати (рис. 4D). Часто сообщалось о компромиссе между количеством и массой зерна в пшенице, что объясняется неконкурентоспособными причинами [54, 56]. Когда количество зерен и урожайность были увеличены, доля более мелких зерен в дистальных положениях шипов также увеличивалась, тем самым снижая средний вес зерна [57].Однако такая точка зрения не может быть подтверждена здесь, потому что прирост зерна и урожайность в элитах пропорционально распределены по всему колосу, а не предпочтительно выше в дистальных областях (рис. 4C). Присутствие более мелких дистальных зерен можно скорее отнести к ограничению и / или конкуренции снабжения ассимилятов на уровне всего колоса, поскольку количество зерен может быть изменено ассимилятами, выделенными на колосе [58]. Эктопическая экспрессия переносчика сахарозы в эндосперме пшеницы увеличивала индивидуальную массу зерна, но уменьшала количество зерен на колос [59, 60].Таким образом, эти генотипы могут пострадать от конкуренции между зерном за ассимиляты и, следовательно, от потенциальных ограничений в поставке колоса. Различные функции могут контролировать поступление ассимилятов, такие как загрузка и разгрузка в сосудистой системе и транспортировка на короткие расстояния в спайке, рахисе и колосках [61].

Необходима дальнейшая валидация GDAS и GYDAS для подтверждения практического использования в селекции растений

Так как количество зерен в колоске коррелирует с урожайностью колосков (0.73 для генетических ресурсов и 0,83 для элитных сортов) GDAS и GYDAS очень похожи. Таким образом, на практике обе характеристики можно измерить как взаимозаменяемые. Хотя селекция практически не изменила GDAS и GYDAS, это не исключает использования этих признаков для косвенного отбора урожая зерна. Чтобы оценить способность GDAS и GYDAS в качестве косвенных признаков для отбора урожая зерна, следует провести эксперимент, в котором достаточно вариаций по этим трем признакам в пределах базовой популяции, а растительный материал отбирается исключительно на основе косвенных признаков или сам урожай зерна.Сравнение генетических выгод, достигнутых обеими процедурами, покажет преимущества непрямого отбора с использованием GDAS и GYDAS по сравнению с прямым отбором по урожайности зерна.

Заключение

Селекция существенно увеличила количество зерен на площади в элитах за счет увеличения количества зерен на колос и колоски без особого увеличения TGW. Очевидно, что не было предпочтительного выбора большего количества колосков на колос, потому что это может увеличить количество зерен на колос, но не урожайность, и с потенциальной компенсацией в TGW и / или зернах на колос.Несмотря на то, что ограничение поглощения было уменьшено за счет выделения большего количества ассимилятов в колосья, неравномерный вклад отдельных колосков в урожайность оставался стабильным. Ограниченный успех в улучшении архитектуры колоса предполагает, что либо этот признак не был нацелен на селекцию, либо его поддержание отражает характерные особенности физиологии и развития колоса, которые нелегко изменить с одновременным увеличением урожайности. Манипулирование неравномерным числом зерен или распределением урожайности колосков вдоль колоса может дать повышение урожайности, возможно, за счет решения проблемы загрузки ассимилятов, разгрузки в сосудистой системе и переноса на короткие расстояния в колоске, рахисе и колосках.Эти особенности контролируют и ограничивают транспортные возможности и конкуренцию между колосками и зерном.

Список литературы